新型口蹄疫合成肽诊断试剂盒

 

      UBI^®口蹄疫病毒结构蛋白（VP1）

免疫抗体检测ELISA试剂盒（猪/反刍动物）

UBI^® FMDV VP1 EIA（SWINE/RUMINANT）

      UBI^®口蹄疫病毒非结构蛋白（NS）

感染抗体检测ELISA试剂盒（猪/反刍动物）

UBI^® FMDV NS EIA（SWINE/RUMINANT）

 

 

　　口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）所引起的一种偶蹄动物的烈性传染病，其危害不只在于动物的死亡（除幼年动物死亡率高达50％，成年动物的死亡率一般低于5％），更重要的是该病传播迅速，流行广泛，对感染地区的畜牧业造成重大经济损失。对动物和动物产品的国际贸易及各国政治经济的稳定，造成了很大影响，因此又被称为“政治经济病”，倍受各国政府的重视。国际兽医局（OIE）将其列为A类传染病。

 

　　FMD的扑灭，除要有高效的疫苗和合理的免疫计划外，还必须依据有效的监测手段，以评价免疫效果并及时发现感染动物。多年来，国内外专家在FMD诊断试剂的研发上做了不懈的努力，取得了许多科研成果。

 

　　中牧股份在农业部的大力支持下，从美国联合生物医学公司（简称UBI）引进并开发出一种以人工合成肽为抗原的新型口蹄疫合成肽诊断试剂盒，在高效、特异、快捷及生物安全性上实现了较完美的结合。该试剂盒在南美、欧洲、中国大陆和台湾等地区的实际应用效果十分理想，为口蹄疫疫情的监测提供了有效的方法。

 

　　目前，此试剂盒已被我国国家质量监督检验检疫总局确定为国家进出口动物口蹄疫检验检疫的指定试剂盒。

 

 

　　新型口蹄疫合成肽诊断试剂盒，其包被抗原采用了代表二十一世纪生物技术水平的人工化学合成生物因子技术生产的纯净合成肽，与传统的采用灭活病毒和重组蛋白方式生产的抗原相比，具有无可比拟的优越性：

 

        合成肽是化学合成，生产过程中无需接触和使用病毒（强毒和弱毒），无生物安全隐患。

 

        不含任何其它杂质蛋白，特异性强。

 

        合成的抗原位点具有高效性，灵敏度高。

 

        试剂盒在严格GMP管理下生产，质量稳定性高。

 

        大量试验证明，可重复性好。

 

        可区分健康动物、感染动物和疫苗免疫动物。

 

        试剂盒提供了全套试剂，使用极为方便，操作简单、快捷，方便临床实际应用。

 

        VP1试剂盒可以通过检测血清抗体，监测疫苗的免疫效果，为养殖场群体免疫水平提供监测手段。

 

        NS试剂盒无血清型的特异性，对任何血清型的口蹄疫病毒感染都可以提供血清学参考诊断方法。

 

 

　　本试剂盒是采用合成肽作为包被抗原进行的特异性体外定性酶免疫分析法，用于检测猪及反刍动物血清中的FMDV抗体。

 

      FMDV-VP1试剂盒包被的是人工化学合成的代表了FMDV VP1区中具有高度抗原性的蛋白片断，用于检测免疫抗体（疫苗注射和感染FMDV后均可产生此类抗体）；

 

      FMDV-NS试剂盒包被的是人工化学合成的代表了FMDV非结构蛋白3B中具有高度抗原性的蛋白片断，用于检测感染抗体（只有动物感染FMDV，才有此类抗体产生）；

 

      FMDV-NS与FMDV-VP1试剂盒联合使用，可区分口蹄疫病毒感染动物、疫苗免疫动物和正常动物。

 

 

 

　　本试剂盒是采用口蹄疫病毒合成肽固相化抗原包被于微孔板的微孔表面上。这些多肽代表了FMDV结构蛋白VP1或非结构蛋白中具有高度抗原性的蛋白片断。在实验中，在相应的反应孔中加入稀释的对照和待检血清，经孵育后，若样品中含有口蹄疫病毒特异性抗体，则将与多肽抗原结合而吸附于反应孔表面，经洗涤除去未结合抗体和样品其他组份后，再加入辣根过氧化物酶标记的基因重组蛋白A/G，同已结合在反应孔内的样品中的口蹄疫病毒抗原抗体复合物发生特异性结合，再经洗涤除去未结合的酶结合物，在各孔中加入TMB底物工作液，将产生酶分解TMB的蓝色产物，其颜色的深浅与待检样品中口蹄疫病毒特异性抗体含量成正比，加入H₂SO₄溶液终止反应后，用酶联读数仪450nm波长测定各反应孔中的OD值。

 

 

1.       使用前将试剂盒恢复到室温，避免阳光直射或放置在30℃以上的环境中。

 

2.       取出试剂盒中的样品稀释板，A1、B1两孔作为阴性对照孔，C1、D1两孔作为阳性对照孔，其余孔作检测孔，每孔一个样品。

 

3.       在稀释板的各孔中加入200ml样品稀释液，在相应各孔中分别加入10ml对照血清或被检血清样品，用加样器重复吹吸数次，稀释每个样品时必须使用不同吸头。

 

4.       取出抗原包被板。

 

5.       分别从稀释板上取稀释后的对照血清和被检血清各100ml，加至抗原包被板的相应孔中，加盖或封膜后，置37±2℃下孵育60±5分钟。

 

6.       洗涤工作液配制：按需要量，用去离子水或双蒸水将洗涤液作25倍稀释。

 

7.       用洗涤工作液洗涤抗原包被板，每孔300ml，洗涤6次，拍干。

 

8.       酶结合物工作液配制：用酶结合物稀释液将酶结合物作100倍稀释，现配现用。

 

9.       每孔加入100ml酶结合物工作液，加盖或封膜后，置37±2℃下孵育30±2分钟。

 

10.   重复7。

 

11.   TMB底物工作液配制：将TMB底物B液和TMB底物A液等量混合，现配现用。

 

12.   每孔加入100mlTMB底物工作液，加盖或封膜后，置37±2℃下孵育15±1分钟。

 

13.   每孔加入100ml？终止液，并轻轻振荡混匀。

 

14.  在15分钟内，用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD值。

 

 

 

1.     试验有效的条件：

 

²        FMDV-NS试剂盒：阴性对照孔平均OD值应≤0.15，每个阳性对照孔OD值≥0.5，且≤2.0，否则，试验无效。

 

²        FMDV-VP1试剂盒：阴性对照孔平均OD值应≤0.20，每个阳性对照孔OD值≥0.5，且≤2.0，否则，试验无效。

 

2.     计算临界值： 临界值＝0.23×阳性对照孔平均OD值

 

3.       被检样品孔OD值＜临界值时，判为阴性。

 

4.       被检样品孔OD值≥临界值时，判为阳性。

 

²        若使用FMDV-NS试剂盒，则为抗口蹄疫病毒非结构蛋白抗体阳性，此抗体可能源于FMDV感染。

 

²        若使用FMDV-VP1试剂盒，则为抗口蹄疫病毒VP1蛋白抗体阳性，此抗体可能源于疫苗注射或FMDV感染。

 

5.       对判定结果为阳性的样品，应用2个孔进行重复检测，重复检测后，若至少有一个孔为阳性，则判为阳性，若两孔均为阴性，则判为阴性。

 

6.       当FMDV-NS试剂盒与FMDV-VP1试剂盒联合使用时，按下列标准进行最终判定。

 

VP1试剂盒 NS试剂盒	＋	—
＋	感染动物	感染动物
—	疫苗接种动物	正常动物

 

 

 

² 应严格按说明书操作，不同批号的组成成分不能混用。

 

² 口蹄疫的诊断只能以临床检验或分离病毒来判断，单独的血清学测定不能绝对确诊口蹄疫。阴性结果不能排除个别动物感染FMD的可能性。

 

² 储存温度2－8℃。

 

² 请在试剂盒规定的效期内使用。

 

 

 

 

 

批号	阴性对照OD值	阳性对照OD值
0362001	0.098 0.105 0.118 0.118	1.234 1.180 1.200 1.205
0355001	0.094 0.100 0.108 0.097	1.064 1.146 1.126 1.086
1158003	0.135 0.128 0.134 0.131	1.188 1.181 1.213 1.268
平均值 标准差（SD） 变异系数（CV）	0.113 0.015 13.0%	1.174 0.057 4.8%

 

表3 试剂盒批间可重复性试验 

 

批号	阴性对照OD值	阳性对照OD值
M055010	0.107 0.111 0.122	1.329 1.484 1.298
M055020	0.124 0.112 0.115	1.226 1.225 1.194
M055030	0.143 0.132 0.140	1.205 1.168 1.279
平均值 标准差（SD） 变异系数（CV）	0.123 0.013 10.6%	1.271 0.095 7.5%

 

 

 

 

 

 

　　为了验证该试剂盒的有效性，在美国梅岛和中国台湾，经过大量试验证明，特异性达到98％以上，灵敏性高达100％，经农业部畜牧兽医局批复和许可，我们从2000年6月起，在兰州对UBI提供的诊断试剂盒进行了大规模的动物血清学验证性实验（双盲实验）。试验结果非常理想。

 

 

　　1. 猪用FMDV-NS和FMDV-VP1试剂盒检测结果

 

 

　　2. 反刍动物FMDV-NS和FMDV-VP1试剂盒检测结果

 

 

　　3. VP1试剂盒与乳鼠中和试验（MSN）检测结果比较